摘 要：目的 建立枳。考参和撑支供提制机用实薤白桂枝汤（Zhishi Xiebai Guizhi Decoction，ZXGD）HPLC指纹图谱，并结合网络药理学，预测ZXGD潜在的质量标志物（quality markers，Q-Marker）。方法 首先建立ZXGD的HPLC指纹图谱的检测方法，并对共有峰进行指认和归属，应用网络药理学方法构建ZXGD的“成分-靶点-通路”网络关系，对其潜在的Q-Marker进行预测。结果 ZXGD的HPLC指纹图谱共标定17个共有峰，并指认出7个色谱峰；采用网络药理学方法，筛选出34个核心靶点、8条代谢通路，根据化合物、靶点以及信号通路之间的连接度，初步预测厚朴酚、和厚朴酚、辛弗林、邻甲氧基肉桂醛4个成分为ZXGD潜在的Q-Marker。结论 通过HPLC指纹图谱结合网络药理学分析预测ZXGD治疗疾病潜在的Q-Marker，所建立的方法操作简便，重复性好，可用于ZXGD的质量控制，也为深入研究ZXGD的质量标准和作用机制提供支撑和参考。
枳实薤白桂枝汤（ZhishiXieb。]6-2[等病疾谢代ai Guizhi Decoction，ZXGD）收录于国家中医药管理局公布的第一批《古代经典名方目录》，最早记载于东汉•张仲景《金匮要略•胸痹心痛短气病脉证治第九》[1]，处方由枳实、薤白、桂枝、厚朴、瓜蒌组成，具有通阳散结、祛痰下气之功效，主治胸痹。现代临床研究表明，ZXGD应用广泛，可用于治疗心脏类疾病，如心肌梗死、冠心病等，消化系统疾病，呼吸道疾病和代谢疾病等[2-6]。
由于ZXGD由多味药组成，药味配。考参供提究研伍关系和成分较为复杂，饮片质量也参差不齐，对于ZXGD整体性质量控制方面的研究较少，因此，建立能够全面阐述ZXGD复方特点的方法具有重大意义。2016年刘昌孝院士[7]提出中药质量标志物（quality markers，Q-Marker）的新思路，并明确了Q-Marker的五大原则分别是特有性、有效性、传递与溯源、可测性和配伍环境。Q-Marker是特有的可定性、定量的化学成分，贯穿中药到制剂的全过程，为中药质量标准的整体性建立提供新思路。中药指纹图谱是以中药化学成分为研究基础，对含有复杂成分的物质采用特定的分析技术，可用于药材、饮片以及中药制剂产品质量的整体性评价[8]。网络药理学可从整体性、系统性出发，将中药的研究模式从传统的“单药物、单靶点”转变为“多组分、多靶点、多途径”，同时还可揭示“药物-基因-靶点”之间的相互作用关系[9]。通过构建网络药理学的网络拓扑学关系图，能形象地反映中药发挥药效的特点，更加直观地阐明药物配伍的作用机制，增加中药复方临床应用的科学性，对揭示中药和中药复方的内在作用机制有着巨大贡献，也为经典名方的研究方向提供更多的选择[10]。目前基于网络药理学的方法，已对清络饮和六味地黄丸的作用机制的有效性进行了证实[11]。本研究从Q-Marker的五原则出发，以ZXGD为研究对象建立指纹图谱，结合网络药理学，预测分析ZXGD发挥药效作用的潜在Q-Marker，为后续ZXGD的质量控制和机制研究提供参考。
1 仪器与材料
1.1 仪器
LC-20AD型岛津高效液相色谱仪，日本Shimadzu公司，包括LC-20ADXR低压梯度泵（四元）、CTO-20AC柱温箱、DGU-20A5R在线脱气装置、SIL-20AXR自动进样器、SPD-M20A PDA检测器、CBM-20A色谱工作站；MS105DU型电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；KQ-500B型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；H1650-W型台式高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；FA1104N型电子天平，上海菁海仪器有限公司；TD1002C型电子天平，天津天马衡基仪器有限公司；冷冻干燥机，上海利闻科学仪器有限公司。
1.2 试药
对照品邻甲氧基肉桂醛（批号S28D9G711659，质量分数98.0%）购自上海源叶生物科技有限公司；对照品辛弗林（批号110727-201809，质量分数99.5%）、橙皮苷（批号110721-201818，质量分数96.2%）、肉桂酸（批号110786-201604，质量分数98.8%）、桂皮醛（批号110710-201821，质量分数99.6%）、和厚朴酚（批号110730-201614，质量分数99.3%）、厚朴酚（批号110729-201714，质量分数100.0%），均购自中国食品药品检定研究院。
ZXGD由枳实、厚朴、薤白、桂枝、瓜蒌5味中药组成，研究所用药材均来自道地产区或主产区。本实验前期已完成药材检测，并依据《中国药典》2020年版各味药项下标准将药材炮制成对应饮片。枳实（江西省樟树市新干县，批号ZS-M1811001～ZS-M1811005），厚朴（湖北省恩施州鹤峰县，批号HP180608～HP180612），薤白（吉林省四平市梨树县，批号XB180320～XB180324），桂枝（广东省肇庆市德庆县，批号GZ-181011～GZ-181015），瓜蒌（山东省济南市长清县，批号GL181015～GL181019），经南京中医药大学药学院陈建伟教授鉴定，5味药的基原分别为芸香科柑橘属植物酸橙Citrus aurantium L.的干燥幼果、木兰科木兰属植物厚朴Magnolia officinalis Rehd. et Wils.的干燥干皮、百合科葱属植物小根蒜Allium macrostemon Bge.的干燥鳞茎、樟科樟属植物肉桂Cinnamomum cassia Presl的干燥嫩枝、葫芦科栝楼属植物栝楼Trichosanthes kirilowii Maxim.的干燥成熟果实。本实验共研究由各批次饮片随机组合的20批ZXGD。
1.3 试剂
乙腈，色谱纯，德国Merck公司；纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司；甲醇，分析纯，国药集团化学试剂有限公司。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水，梯度洗脱：0～5 min，1%～5%乙腈；5～10 min，5%～8%乙腈；10～25 min，8%～10%乙腈；25～30 min，10%～15%乙腈；30～45 min，15%～18%乙腈；45～50 min，18%乙腈；50～55 min，18%～20%乙腈；55～57 min，20%～23%乙腈；57～77 min，23%～25%乙腈；77～82 min，25%～30%乙腈；82～93 min，30%～45%乙腈；93～96 min，45%乙腈；96～103 min，45%～65%乙腈；103～121 min，65%～95%乙腈；121～126 min，95%～1%乙腈；126～136 min，1%乙腈；检测波长290 nm；柱温30 ℃；体积流量1.0 mL/min；进样量10 μL。
2.2 对照品溶液的制备
分别取各对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成含肉桂酸2.02 μg/mL、桂皮醛7.82 μg/mL、和厚朴酚1.43 μg/mL、厚朴酚0.80 μg/mL、邻甲氧基肉桂醛98.20 μg/mL、辛弗林56.52 μg/mL、橙皮苷306.00 μg/mL的混合对照品溶液。
2.3 样品制备
《金匮要略》中ZXGD的原方组成：“枳实四枚，厚朴四两，薤白半斤，桂枝一两，栝蒌实一枚（捣）”，用法用量为“上五味，以水五升，煮取六升，先煮枳实厚朴取二升，去滓，内诸药，分温三服”[1]。经文献考证，按照1两等于3 g，1升等于200 mL进行换算，枳实4枚约为9 g，瓜蒌实为15 g。称取处方中枳实和厚朴置于陶瓷锅中，加水1000 mL浸泡1 h，半开盖，武火煎煮至沸腾，转文火并保持微沸继续煎煮至400 mL，以2层纱布趁热滤过，并收集滤液。再称取薤白、桂枝和瓜蒌加入上述滤液中，浸泡1h，半开盖，武火煎煮至沸腾，转文火并保持微沸继续煎煮至100 mL，2层纱布滤过，滤液放冷至室温。取滤液至−80 ℃冰箱预冻12 h，转移至冷冻干燥机，于−54 ℃、0.74 Pa真空度冷冻干燥为冻干粉，即得。根据上述制备方法，共得到20批ZXGD（编号S1～S20）冻干粉以及5味药的单煎和阴性水煎液的冻干粉各1批。
2.4 供试品溶液的制备
取“2.3”项下10 mL煎煮液所对应的冻干粉，置50 mL量瓶中，加入甲醇35 mL，加蒸馏水至刻度，称定质量，超声处理（功率500 W、频率40 kHz）30 min，放冷，称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.5 方法学考察
2.5.1 参照峰选择 在本研究所建立的指纹图谱中，橙皮苷化学性质稳定，峰面积稳定、峰形较佳、分离度较好、保留时间适中，因此选择橙皮苷为参照峰，以计算其余峰的相对峰面积和相对保留时间。
2.5.2 精密度试验 取ZXGD 1份（S1），按照“2.4”项下确定的方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件连续进样6次，计算共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果显示，共有峰的相对保留时间RSD＜1.3%，相对峰面积RSD＜4.0%，表明仪器精密度良好，可用于ZXGD指纹图谱的测定。
2.5.3 稳定性试验 取ZXGD 1份（S1），按照“2.4”项下确定的方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h按照“2.1”项下色谱条件进样，计算共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果显示，共有峰相对保留时间RSD＜1.4%，相对峰面积RSD＜4.3%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.5.4 重复性试验 取ZXGD（S1）1份，按照“2.4”项下确定的方法制备供试品溶液，平行制备6份，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，计算共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果显示，共有峰相对保留时间RSD＜1.9%，相对峰面积RSD＜4.7%，表明该方法重复性良好，可用于ZXGD指纹图谱的测定。
2.6 指纹图谱的建立和相关性分析
2.6.1 ZXGD指纹图谱建立 取ZXGD 20批（S1～S20），按照“2.4”项下确定的方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行测定。将所得图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012A版），选择S1号图谱为参照图谱，采用平均数法，进行全峰匹配，得到20批ZXGD的指纹图谱叠加图，见图1。
2.6.2 ZXGD相似度分析 将20批ZXGD样品的指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012A版），计算相似度。结果S1～S20样品的相似度分别为0.952、0.976、0.973、0.961、0.983、0.990、0.982、0.976、0.958、0.983、0.981、0.982、0.991、0.976、0.966、0.965、0.978、0.968、0.965、0.985。20批ZXGD的指纹图谱相似度均＞0.95，表明ZXGD的质量稳定均一。
2.6.3 ZXGD共有峰的归属及指认 根据指纹图谱的分析结果，分别将单味药供试品溶液、相应缺单味药的阴性供试品溶液和ZXGD供试品溶液的指纹图谱进行叠加，对共有峰进行归属，结果见图2。ZXGD中共有17个共有峰，其中1、8、9、11、15号峰来自枳实；12～14号峰来自桂枝；5、6、10、16、17号峰来自厚朴；4号峰来自瓜蒌；2、3号峰在枳实、薤白、瓜蒌中均存在；7号峰在枳实、厚朴中均存在。
将混合对照品溶液和ZXGD供试品溶液的指纹图谱进行叠加，对共有峰进行指认，结果见图3。
对照品指纹图谱共指认出7个共有峰，分别是1号峰辛弗林、11号峰橙皮苷、12号峰肉桂酸、13号峰桂皮醛、14号峰邻甲氧基肉桂醛、16号峰和厚朴酚、17号峰厚朴酚。因此得到ZXGD共有峰的归属和指认结果见表1。
2.7 网络药理学预测分析
2.7.1 化合物-靶点的预测 通过检索PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中辛弗林、橙皮苷、肉桂酸、桂皮醛、邻甲氧基肉桂醛、和厚朴酚、厚朴酚7个化合物的SMILES，并将SMILES分别导入Swiss Target Prediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）预测分析相对应的靶点，去除重复靶点，共得到与7个化合物相关的231个作用靶点。
2.7.2 蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络构建 将筛选出的231个作用靶点，导入STRING数据库（http://string-db.org/cgi/input.pl）构建蛋白PPI网络，选择物种为“Homo sapiens”，选择隐藏网络中无联系节点，最小交互值（minimumrequired interaction score）为最高置信度（highest confidence）＞0.9，获得PPI的网络图，见图4，共获得231个节点，6788条边。将上述分析结果以TSV格式导入Cytoscape 3.7.2软件中，并利用此软件筛选出度（degree）参数≥10，介数中心性（betweenness centrality）和接近中心性（closeness centrality）均大于中位数的靶点共34个作为核心靶点，结果见表2。
2.7.3 基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析 将筛选得到的34个核心靶点利用Metascape数据库（https://metascape.org/gp/index.html）对其进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，见图5、6。GO功能富集分析可以用于描述基因靶点在生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cell component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3大层面上的功能。KEGG通路富集分析除了可以对基因本身功能进行注释，也可以得到与基因靶点相关的信号通路。富集分析均以P＜0.01具有统计学意义。
在GO富集分析中，共得到40个GO条目，其中BP占20个，CC占9个，MF占11个。生物过程显著富集在蛋白激酶活性调节、细胞对氮化合物的反应、肽基丝氨酸磷酸化和腺苷酸环化酶调节G蛋白偶联受体信号通路等过程；细胞组成显著富集在突触后膜、树突等区域；分子功能显著富集在蛋白激酶结合、G蛋白偶联胺受体活性和蛋白质同源二聚活性等功能。
在KEGG富集分析中，共得到8条主要通路。富集到的通路主要涉及神经活性配体-受体相互作用（neuroactive ligand-receptorinteraction）、环腺苷酸信号通路（cAMPsignaling pathway）、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶通路（PI3K-Akt signaling pathway）等，表明34个核心靶点可能是主要通过调节这些通路来起到治疗或干预疾病的作用。
2.7.4 成分-靶点-通路网络构建 根据筛选得到的ZXGD中7个化合物、34个核心靶点和8条代谢通路，使用Cytoscape 3.7.2软件，并根据化合物、靶点以及信号通路之间的连接度，构建ZXGD中的“成分-靶点-通路”可视化网络图，见图7。由图可知，ZXGD是通过多成分、多靶点、多通路的协同作用达到发挥治疗作用的目的。在7个化合物中，厚朴酚、和厚朴酚、辛弗林、邻甲氧基肉桂醛4个成分有较高的连接度；在34个核心靶点中，RAF1、DRD2、RELA、CHRM2、ADRB2、CHRM1的连接度也高于其他靶点；在8条代谢通路中，神经活性配体-受体相互作用、孕酮介导的卵母细胞成熟、环腺苷酸信号通路、PI3K-Akt通路、cGMP-PKG信号通路、缝隙连接的连接度相对较高。
2.7.5 整合分析 ZXGD主治胸痹，现代临床治疗较为广泛。对治疗心脏相关疾病[12-15]、消化系统疾病[16-17]、呼吸系统疾病[18-19]及代谢性慢性疾病[20]均有显著疗效。GO富集分析中显示，ZXGD对蛋白激酶活性调节过程、细胞对氮化合物的反应过程、突触后膜区域等途径具有广泛调节的作用。在KEGG富集分析中显示，ZXGD主要调节神经活性配体-受体相互作用、环腺苷酸信号通路、缝隙连接等相关信号通路。
研究发现，神经活性配体-受体相互作用通路与胃癌患者的肿瘤突变负荷（tumor mutationburden，TMB）关系密切[21]，还可参与非小细胞肺癌的病因学，使得其在肿瘤的IA、IIA、IIIB和IV阶段被激活。而孕酮介导的卵母细胞成熟可在肺腺癌的所有阶段（IA、IB、IIA、IIB、IIIA、IIIB和IV）都可被激活[22]。环腺苷酸信号通路在促进细胞的生存、分化等方面发挥了关键的作用，同时还可以修复神经元的损伤，起到改善衰老、提高记忆能力和认知能力的作用[23]。Wang等[24]实验研究已经证明还可以通过激活环腺苷酸信号通路，抑制炎症因子的释放，从而预防小鼠急性肺损伤和慢性阻塞性肺疾病。通过激活PI3K-Akt通路可以促进胰岛素的分泌和减少肝细胞的脂质积累，产生抗糖尿病的活性[25]。心肌缺血再灌注损伤的主要调控机制是细胞的凋亡和自噬，而PI3K-Akt通路是可以破坏心肌缺血再灌注损伤疾病的自噬和凋亡，从而起到治疗作用[26]。PI3K通路还可以调节抗氧化酶来抵抗氧化应激，从而发挥心血管保护作用。cGMP-PKG信号通路可能是调节不同的生物学功能来参与心力衰竭的发病机制。在心肌缺血再灌注损伤中，缝隙连接可以增强细胞的通透性，促进离子在细胞之间的传递，从而导致钙超载，而ZXGD可以对缝隙连接产生保护作用，干预钙超载传递和扩散过程，对心肌产生明显的保护作用，最终产生抗心肌缺血再灌注损伤的作用[27]。另有研究表明，环腺苷酸信号通路、PI3K-Akt通路和cGMP-PKG信号通路均是慢性心力衰竭疾病相关作用通路[28]，而且神经活性配体-受体相互作用通路和PI3K-Akt通路可以修复神经血管平滑肌坏死、脂质代谢、炎症等途径从而发挥抗冠心病的潜力[29]。
上述文献研究表明，网络药理学预测的结果与现有相关文献较为接近，说明该研究方法具有一定的准确性和可靠性，同时也与中药整体性的观念相契合，为近一步阐述ZXGD的物质基础提供了参考。ZXGD中多个关键性成分可作用于多个核心靶点，从而干预多个作用通路，起到治疗或干预疾病的作用。结合Q-Marker的基本要求、指纹图谱和上述网络药理学分析，故可初步预测厚朴酚、和厚朴酚、辛弗林、邻甲氧基肉桂醛是ZXGD潜在的Q-Marker。
3 讨论
中药质量是中药及相关产业的生命线，质量的优劣可制约和影响中药产业的健康和发展。提高中药质量，就是做好顶层设计。中药Q-Marker的建立可以促进中药标准的质量控制研究，加强中药质量评价体系的建立。
本实验在优化供试品溶液提取条件时，分别考察了不同比例甲醇（60%、70%、80%）对提取率的影响，最后结果表明，以70%甲醇作为提取溶剂时，各色谱峰峰面积较高，提取率较好，故而选择70%甲醇作为提取溶剂。本实验在优化色谱条件时，考察了不同的检测波长（214、254、290 nm），不同厂家的色谱柱（Kromasil C18、Hanbon Hedera ODS-2、Waters XBridge C18），不同的流动相系统（甲醇-水、乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-水），不同柱温（25、30、35 ℃）对色谱峰的影响。考察结果表明，选取波长290 nm、Kromasil C18色谱柱、乙腈-水流动相、温度为30 ℃时，色谱峰峰形良好、分离度佳、基线平稳。
在进行色谱峰归属分析时发现，2、3号峰在枳实饮片、薤白饮片、瓜蒌饮片中均存在，7号峰在枳实饮片和厚朴饮片中均存在，可能是由于枳实、薤白和瓜蒌，枳实和厚朴中存在结构、性质相类似的成分，目前选择的色谱条件未能将其分开，或者不同药味中存在同一种化学成分，因此对这3个峰的归属产生困难。后期将采用双阴性实验等对这3个峰的归属进行进一步的研究和探讨。
本实验通过建立ZXGD的指纹图谱，结合网络药理学研究，ZXGD中厚朴酚、和厚朴酚、辛弗林、邻甲氧基肉桂醛4个成分均具有传递性和溯源性，可初步预测厚朴酚、和厚朴酚、辛弗林、邻甲氧基肉桂醛为ZXGD的潜在Q-Marker。为后期对ZXGD的质量控制提供依据和参考，也为深入研究ZXGD的作用机制提供理论的支撑。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：徐瑞杰，薛 蓉，梅 茜，宫静雯，张 倩，赵晓莉，严国俊，毛春芹，许金国，陆兔林．基于指纹图谱和网络药理学的枳实薤白桂枝汤质量标志物预测 [J]. 中草药, 2022, 53(2): 372-381.